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许多天然生物材料，如蜘蛛丝和柞蚕纤维，都表现出优异的低温耐受性。这些材料中固有的分子结构和分级组织对于控制其在低温下令人羡慕的延展性和韧性至关重要。然而，由于产量低，天然蜘蛛丝无法通过养殖蜘蛛来实现大规模生产，难以扩大应用。近年来，尽管重量轻且机械强度高的蛋白质纤维在环境条件下显示出出色的应用场景，但这些常规纤维材料往往容易受到环境的影响，尤其是低温下的机械性能。因此，迫切需要建立一种新的策略来设计具有优异环境耐受性，特别是抗冻性的机械强度高的生物纤维。
日前，中国科学院大学苏娟娟研究员利用基因工程制备了一类具有良好的抗冰能力和低温机械性能的耐冻蛋白纤维。其中，受大自然启发，嵌合重组蛋白由高度有序的结构蛋白结构域和抗冻蛋白（AFP）模块组成，具有优异的冰重结晶抑制活性。这些特性使所得蛋白质纤维在零下环境中具有显著的机械性能和良好的机械稳定性。与传统纤维形成鲜明对比的是，该工程蛋白纤维即使在-20和-40 °C下也能保持高低温刚度和韧性。结构蛋白和AFP的协同作用对非凡的抗冻力学行为起着重要作用。因此，这项工作为下一代生物纤维开辟了一种工程方法，可在极端环境中进行定制应用。相关工作以“Bioengineered Protein Fibers with Anti-Freezing Mechanical Behaviors”发表在《Advanced Functional Materials》。
图1. 利用基因工程设计由AFP模块和结构蛋白启发模块组成的新型重组嵌合蛋白
新型重组嵌合蛋白的设计及制备
为了探索抗冻纤维的制备，研究者通过基因工程合理设计了由AFP模块和结构蛋白启发模块组成的新型重组嵌合蛋白。其中选择了两种类型的AFP，包括来自海嘴鱼的III型AFP（T3AFP）和来自雪蚤的富含甘氨酸的AFP（SnAFP）（图1A）。T3AFP是一种≈7 kDa球状蛋白，具有抗冰活性，由蛋白质IBS上的一组残基介导，而SnAFP在第一个位置具有与甘氨酸的串联三肽重复序列，并表现出与T3AFP不同的定义的3D结构。然后将AFP模块与称为K72的弹性蛋白样多肽或称为eSRT的鱿鱼环齿蛋白的工程版本融合。eSRT由（VPGKG）5序列和富含丙氨酸的序列（PAATAVSHTTHHAP）组成，由于分子间疏水相互作用和氢键，该序列负责形成结晶β-折叠（图1B），有利于材料的机械强度。得益于AFP的内在特性，与非AFP蛋白纤维相比，具有AFP的重组蛋白纤维在零下条件下可有效抑制冰晶生长（图1C）。
图2. 重组嵌合蛋白的抗冻作用
重组嵌合蛋白的抗冻作用
接下来，通过冰重结晶抑制（IRI）测定研究了这些重组嵌合蛋白的抗冻作用。研究者发现在PBS和牛血清白蛋白（BSA）组中均观察到显著的冰再结晶, 大冰晶的产生证明了这一点 (图2A-B)。相比之下，重组蛋白组显示出尺寸较小的冰晶，表明冰的快速生长受到抑制。为了定量表征抗冻活性，研究者通过测量和计数视野中的所有晶体来探索平均晶粒尺寸（MGS）（图2C）。值得注意的是，T3-eSRT-T3在低至0.25 mg mL-1的浓度下表现出有效的抗结冰活性（图2D）。这些结果表明，T3AFP或SnAFP的存在将促进重组蛋白的整体抗冻作用，表明它们在设计抗冻材料方面的潜力。
图3. 纤维在低温和室温下表面形态的变化
纤维在低温和室温下表面形态的变化
研究者进一步研究了这些纤维在低温（-40 °C）和室温（25 °C）下的表面形态（图3A）。所有纤维在室温下均光滑均匀。然而，在-40 °C下观察到不同的纤维表面形态。由于K72的无规卷曲结构，K72纤维在-40 °C时出现许多不规则裂纹。K72的固有结构具有许多与冰晶接触的活性位点，因此在低温下会形成粗糙的表面。与此形成鲜明对比的是，引入AFP可以抑制冰晶的生长，从而降低表面粗糙度，正如T3-K72纤维所证明的那样。值得注意的是，没有检测到这些缺陷，并且eSRT、T3-eSRT和T3-eSRT-T3纤维中的冰再结晶受到抑制，这表明 eSRT内在序列和β-折叠结构对耐冻性的重要性。因此，AFP模块通过冰结合位点和非冰结合位点的协同作用，帮助纤维在零度以下环境下恢复原貌。扫描电子显微镜（SEM）分析表明，与eSRT纤维相比，T3-eSRT-T3纤维更光滑，截面上的皱纹更少（图3B）。这些发现与IRI分析非常吻合，并进一步验证了AFP模块对调整表面形态的影响。拉伸后的T3-eSRT-T3纤维通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱进行了表征（图3C-D）。结果证明了有序的蛋白质排列以及包括纤维内的α-螺旋和β-折叠在内的详细蛋白质结构，这可能有助于蛋白质纤维的低温结构完整性。
图4. 纤维的低温机械性能
纤维的低温机械性能
研究者通过使用动态机械热分析仪进一步研究了纤维在宽温度范围内的机械性能。在零下和室温下单纤维的典型应力-应变曲线（图4A-B）表明，与室温下的纤维相比，BSA纤维在-40 °C下的断裂强度、韧性和杨氏模量分别降低了 62%、74%和48%。当从室温切换到零下环境时，K72纤维表现出与BSA纤维相似的机械行为（图4C-D）。与室温相比，eSRT纤维的断裂强度和韧性在-40 °C 时降低了一半（图4C-D）。相比之下，T3-K72、T3-eSRT和T3-eSRTT3纤维将保持其较高的低温刚度和韧性（图4E）。以上结果表明，生物合成的蛋白质纤维具有出色的低温机械性能。为了阐明观察到的T3-eSRTT3纤维的高低温机械性能的可能机制，研究者进行了分子动力学模拟分析，以研究低温环境下水分子与蛋白质的相互作用。结果表明AFP结构域可能触发水分子的重排，从而捕获水分子和/或冰晶与一组残基（Gln13、Leu14、Ile17、Asn18、Thr19、Ala20、Thr22、Leu23、Val24 和 Met25）（图4F）。因此，AFP模块为蛋白质纤维提供了“保护层”，提高了抗冻性。
小结：受AFP的启发，研究者提出了一种大规模生产坚固的抗冻蛋白纤维的新方法。通过基因工程，重组嵌合蛋白表现出优异的IRI活性。与环境适应性较差的传统重组蛋白纤维相比，eSRT模块固有的高度有序结构和AFP模块的冰生长抑制功能赋予了生物合成蛋白纤维优异的低温力学性能，包括刚度和韧性。值得注意的是，该蛋白质纤维在零下环境中表现出良好的机械稳定性。这些特性使蛋白质纤维能够用于设计具有出色抗冻性的纺织品，在极端条件下显示出巨大的耐磨性潜力，例如南极洲使用的绳索或北极极地和航空服。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202209006
来源：高分子科学前沿
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